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科研進展

 

李勁松研究組利用“人造精子細胞”介導半克隆技術揭示重要的雄性印記調控區對胚胎發育的時序調節

        近期,中國科學院分子細胞科學卓越創新中心(生物化學與細胞生物學研究所)李勁松研究組在SCIENCE CHINA Life Sciences發表題為“Temporal regulation of prenatal embryonic development by paternal imprinted loci”的封面文章,利用小鼠孤雄單倍體胚胎干細胞 (Androgenetic haploid embryonic stem cells, AG-haESCs,又稱為“人造精子細胞”) 介導的半克隆技術揭示了雄性配子基因組中兩個重要的印記調控區域 (H19-DMR 和 IG-DMR)在出生前胚胎發育過程中的時序調控功能,同時發現敲除H19H19-DMR和IG-DMR的AG-haESCs可以更加高效地支持半克隆胚胎的發育。
 
        20世紀80年代,科學家們通過研究單親胚胎(孤雄或者孤雌)的發育,發現父本和母本的基因組存在差異表達基因,且不可以相互替代,并將這種親本差異表達基因定義為印記基因。印記基因的差異表達通常受親本基因組上的差異甲基化區域 (Differential DNA methylation region, DMR)調控,其中兩個較早發現的DMR區域(H19-DMR和IG-DMR)在父源基因組上的甲基化修飾,調控這兩個印記區域中H19Igf2Gtl2Dlk1Dio3等印記基因的表達。大量研究顯示H19-DMR和IG-DMR在胚胎發育中起到重要的作用,但是,二者是如何協同調控胚胎的發育卻一直沒有被闡釋。
 
        2012年,李勁松研究組建立了小鼠的孤雄單倍體胚胎干細胞,并證明這些細胞能夠代替精子使卵母細胞“受精”產生半克隆小鼠(Yang et al., 2012)。然而,半克隆胚胎的發育率低。進一步研究發現,孤雄單倍體胚胎干細胞中H19-DMR和IG-DMR的甲基化丟失,同時,發育異常的半克隆胚胎也存在H19-DMR和IG-DMR的甲基化丟失;通過刪除孤雄單倍體胚胎干細胞的H19-DMR和IG-DMR模擬該區域的甲基化狀態,使得半克隆小鼠出生效率提高了10倍。因此,攜帶H19-DMR和IG-DMR敲除的單倍體細胞又被稱為“人造精子細胞”(Zhong C et al., 2015)。這些結果提示“人造精子細胞”可以作為非常理想的材料去研究印記調控區域對于胚胎發育的影響。
 
        在本研究中,研究人員首先比較了來源于野生型(wild-type, WT)和DKO (H19-DMR and IG-DMR double knock-out) 單倍體胚胎干細胞的半克隆胚胎的體外發育效率以及半克隆囊胚的轉錄組,發現兩者并沒有顯著差異。具體分析發現,受H19-DMR和IG-DMR調控的H19Igf2Gtl2Dlk1等印記基因在著床前胚胎中的表達水平低,而著床后隨著發育的進程表達量不斷增加,因此DKO沒有對著床前胚胎發生明顯作用。
 
        研究人員進一步將WT和DKO的半克隆胚胎移植到受體母鼠子宮內,并從胚胎期6.5天(E6.5)到E12.5天每天解剖觀察胚胎的發育狀況,發現DKO半克隆胚胎的著床率高于WT。另外,在E12.5,DKO的發育率顯著高于WT。WT的半克隆胚胎從E9.5往后異常發育率不斷增加,胎兒不斷出現發育阻滯和死亡;而DKO半克隆胚胎的發育缺陷出現在E10.5前,之后,大部分胚胎可以正常發育到期。組織學分析發現,WT半克隆胚胎發育異常的主要原因是胎盤和臍帶發育異常導致的胎兒與母體間物質交換受阻,而DKO回補了WT胚胎中異常表達的印記基因,并明顯改善了胎盤發育的異常。
 
        有意思的是,甲基化分析發現異常發育WT半克隆胚胎在E12.5均出現H19-DMR甲基化的擦除,而IG-DMR甲基化擦除存在于異常和正常的胎兒中,暗示著H19-DMR甲基化的正常維持對于半克隆胚胎前半程發育至關重要而IG-DMR的作用不大。為了研究H19-DMR和IG-DMR如何協同發揮功能,研究人員建立了只攜帶IG-DMR敲除的單倍體細胞,發現來源于這些細胞的半克隆胚胎發育率低,且不能發育到期;另外,大部分胚胎在E12.5前發育失敗,且出現H19-DMR甲基化的丟失,這些結果顯示IG-DMR在胚胎發育的前半程并沒有發揮顯著作用。
 
        之前的研究顯示H19-DMR敲除的單倍體細胞能顯著改善半克隆胚胎E12.5的發育效率(Zhong C et al., 2015),然而,H19-DMR敲除并不能模擬父源H19完全失活的狀態。因此,研究人員在單倍體細胞中敲除H19-13kb (包括H19和H19-DMR)以實現父源H19完全不表達,發現,E12.5胚胎的發育狀態較好,與DKO的半克隆胚胎類似。此外,通過轉錄組分析發現H19Δ13kb和DKO的半克隆胎盤與正常的ICSI的胎盤類似,顯著好于WT和IGΔDMR的胎盤。然而,只敲除H19-13kb的半克隆胚胎在E18.5時期出現了大量發育阻滯和退化的胚胎,這些胎兒的IG-DMR的甲基化均出現部分或完全的擦除,說明IG-DMR在胚胎發育的后期具有重要調控作用。最后,研究人員在H19-13kb敲除單倍體細胞中再敲除IG-DMR糾正了H19Δ13kb胚胎后半程發育異常的狀態,從而獲得優于DKO單倍體細胞支持半克隆胚胎發育能力。
 
       綜上,該研究利用單倍體細胞介導的半克隆技術,揭示了父源印記調控區域 (H19-DMR和IG-DMR) 在胚胎發育過程中的時序調控作用;同時,該研究顯示“人造精子細胞”介導的半克隆技術是研究胚胎發育印記調控的有效工具。同期“SCIENCE CHINA Life Sciences”雜志刊發了上海科技大學李夏軍教授的專評文章,充分肯定了“人造精子細胞”介導的半克隆技術在印記的胚胎發育調控研究中的作用,并開創性地回答了父系印記區Igf2-H19Dlk1-Dio3在小鼠的產前胚胎發育調控中的時序作用。
 
        該研究在李勁松研究員的指導下,由博士研究生李慶,博士后李元元,尹奇和王凱,以及上海科技大學的博士研究生黃碩等共同完成。該工作得到了中國科學院、國家科技部、國家基金委和上海市科委經費的支持。李勁松研究員受到中國科學院大學臻溪生命科學基金的支持,該研究還得到了分子細胞中心GTP(基因組標簽計劃)中心、細胞生物學技術平臺和動物實驗技術平臺的支持。
 
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父性印記調控區H19-DMR和IG-DMR在出生前胚胎發育過程中的時序調控功能

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